酵母质粒提取离心法操作步骤

1.         接种5 mL含有酵母携带所需质粒的YDP培养液，将其振荡培养在30℃16-24小时。

2.         取1-3ml酵母培养菌体(使用< 2×107细胞)，室温下5000× g离心5 min。

3.         弃培养液，收集菌体，加入480μL Buffer SE和30μL Lyticase solution。以最快的速度涡旋悬浮1min。充分悬浮细胞颗粒有助于提高得率。将其置于30℃消化30min左右。

注：在使用前确保β-mercaptoethanol已添加到Buffer SE (10µL /毫升)中，这种混合液可以在室温很好的放置时间为1周。

4.         将混合液颗粒在4,000 x g室温离心5min，弃上清完全。

5.         加入250 µL Buffer YPI重新悬浮混合液颗粒。

6.         加入50 mg 玻璃珠，然后以最快速度涡旋5min，让样品在玻璃珠作用下沉降稳定下来。转移上清至一个1.5ml离心管中。

7.         加入250 µL Buffer YPII，反复颠倒混匀离心管4-6次以获得干净的溶解产物。将其室温放置5 min。

注：此步应避免高强度混合，因为这将使染色体DNA断裂以及降低质粒纯度。YPII在存储时要盖紧盖子。

8.         加入350µL Buffer YP III，用手大幅度颠倒混匀样品直到形成絮凝白色沉淀。室温下13,000 × g离心10min。

9.         将干净的上清液小心转移至DNA Mini Column，取上清时尽量不要打扰颗粒与沉淀。室温下10,000 × g离心30s。倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。

10.      向吸附柱中加入500 μL Buffer KB，12,000 rpm转离心30秒，弃收集管与废液。

11.      将吸附柱放入一个新的收集管中，加入650 μL Wash Bufffer（确保已加入乙醇），12,000离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。

注：Wash Buffer 用无水乙醇稀释后使用。

12.      可选步骤：重复步骤11。

13.      13,000 rpm 开盖离心2分钟。

注：开盖离心有助于去除残留乙醇，乙醇的有效去除保证DNA的洗脱。

14.      将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，向柱中加入50-100 µL Elution Buffer(10 mM Tris-HCL, pH 8.5)，室温放置1 min，13,000 x g离心1 min进行洗脱。